Cryo-EM kan worden gebruikt om de structuren van grote moleculaire complexen zoals het oorsprongsherkenningskomplex (ORC) te bepalen.Het ORC herkent en bindt DNA om het proces te starten dat het genetische materiaal van de cel kopieert voordat de cel zich verdeeltHuilin Li, Brookhaven National Laboratory, en Bruce Stillman, Cold Spring Harbor Laboratory.

Wat is cryo-EM en hoe werkt het?

Bij cryo-EM worden cellen, virussen, moleculaire complexen of andere structuren snel ingevroren zodat watermoleculen geen tijd hebben om kristallen te vormen.Wetenschappers gebruiken een elektronenmicroscoop om het bevroren monster met een elektronenstraal te blazenHiermee wordt een tweedimensionale projectie van het monster op een digitale detector gemaakt.Door honderden projecties van de steekproef te maken van vele verschillende hoeken en dan het gemiddelde van deze hoeken te nemenDe laatste ontwikkelingen in de cryo-EM-techniek leveren zeer gedetailleerde beelden van eiwitten en andere biologische structuren.met inbegrip van grotere structuren zoals RNA-eiwitcomplexen.

Inleiding van cryogene elektronenmicroscopie (Cryo-EM):

In het afgelopen decennium heeft cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) steeds meer de traditionele methoden voor het bereiden van monsters voor de elektronenmicroscopie vervangen.Het was het baanbrekende werk van Taylor en Glaeser en van Dubochet en collega's dat de weg vrijmaakte voor deze ontwikkeling., die een kwantumsprong in de biologische elektronenmicroscopie presenteerde, omdat het mogelijk maakte afbeeldingen te verkrijgen van volledig gehydrateerde exemplaren in een nabij de inheemse toestand.

De term cryo-EM verwijst naar verschillende transmissie­elektronen­microscopische beeldvormingsprocedures wanneer deze worden toegepast op monsters die in glas-ijs zijn ingebed.Drie belangrijke takken van cryo-EM zijn relevant in de context van moleculaire structurele biologieHet is de bedoeling dat de Commissie in het kader van haar werkzaamheden met betrekking tot de toepassing van de richtlijnen van de Europese Gemeenschappen, met name de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers, de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers, de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers, de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers en de richtlijnen inzake de bescherming van de gezondheid en de gezondheid van werknemers.

Elektronencrystallografie biedt het voordeel bij het bepalen van de structuur van eiwitten die 2D-kristallen vormen onder 4Å (bijv. zoals blijkt bij watertransportmembraan eiwitten - aquaporines).Membraanproteïnen zijn bijzonder veelbelovende kandidaten voor de vorming van 2D-kristallenDe resoluties zijn groter dan 2 Å. three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.

Eenpartikelanalyse wordt gebruikt voor geïsoleerde en gezuiverde grotere samenstellingen van meerdere subeenheden die vaak zeer heterogeen, metastabiel en extreem moeilijk te kristalliseren zijn (bijv.het ribosoom of het 26S-proteasoom) bij een routine-resolutie van 310 Å en in het beste geval onder 2 ÅMonsterafmeting: 5-150 nm.

Wat is röntgenkristallografie en hoe werkt het?

De röntgenkristallografie schiet een straal röntgenstralen door een klein kristal dat bestaat uit biljoenen identieke eiwitmoleculen.vergelijkbaar met de manier waarop beelden worden vastgelegd in een digitale cameraEen computer meet de intensiteit van de verstrooide röntgenstralen om elk atoom in het gekristalliseerde molecuul een positie toe te wijzen.Deze methode is gebruikt om meer dan 85 procent van de bekende eiwitstructuren te bepalen.

Enkele details over röntgenkristallografie en cryo-EM:

1Kleine eiwitten zijn beter geschikt voor röntgenkristallografie omdat ze moeilijk te onderscheiden zijn door cryo-EM.

2De röntgenkristallografie kan zeer hoge resoluties verkrijgen, hoewel de cryo-EM in de afgelopen jaren vergelijkbare resultaten heeft opgeleverd.

3Grote structuren, complexen en membraanproteïnen kunnen moeilijk te kristalliseren zijn.

4. EM (negatieve vlek) biedt een snelle screening van monsters om aggregatie uit te sluiten en oligomerisering te bepalen, waardoor een visueel overzicht wordt gegeven van het gedrag van het monster en wat het bevat.

5. Cryo-EM vereist minder eiwitten dan röntgenkristallografie. Deze methode kan gunstig zijn voor monsters met een proteïneopbrengst van minder dan 2 mg (< 5-10 mg/ml).*

KS-V peptide cryo-EMDienstenplatform:

• Negatieve kleuronderzoek en berekening van de 2D-classificatie
• Voorbereiding en screening van bevroren rastermonsters
• Verzameling en 3D-reconstructie van gegevens met hoge resolutie, modellering