Samen vormen deze histonmodificaties de zogenaamde histoncode, die de transcriptietoestand van het lokale genoomgebied bepaalt.Het onderzoeken van histonmodificaties in een bepaald gebied, of in het hele genoom, kan gen-activeringstoestanden, locaties van promotors, versterkers en andere genregulerende elementen onthullen.

Histone modificaties in detail
 

Acetylering

Acetylering is een van de meest bestudeerde histonmodificaties, omdat het een van de eerste was die werd ontdekt om de transcriptie-regulatie te beïnvloeden.Onveranderde lysine residuen zijn positief geladen, maar acetylering resulteert in neutralisatie van de lading op histonenHet neutraliseren van de lading resulteert in een zwakker histon: DNA-interactie,De transcriptiefactor bindt en verhoogt de genexpressie aanzienlijk (Roth et al.., 2001).

Histonacetylering is betrokken bij de regulering van de celcyclus, celproliferatie en apoptose en kan een vitale rol spelen bij de regulering van vele andere cellulaire processen, waaronder celdifferentiatie,DNA-replicatie en -herstelEen onbalans in het evenwicht van histonacetylering wordt geassocieerd met tumorigenesis en kankerprogressie.

Enzymatische regulering

Acetylgroepen worden toegevoegd aan lysine-residuen van histonen H3 en H4 door histone-acetyltransferasen (HAT) en verwijderd door deacetylasen (HDAC).bekend als promotor-lokale acetyleringBijvoorbeeld, acetylering van K9 en K27 op histone H3 (H3K9ac en H3K27ac) wordt meestal geassocieerd met enhancers en promotors van actieve genen.Er zijn ook lage niveaus van globale acetylering in alle getranscribeerde genen., waarvan de functie onduidelijk blijft.

Methylering

Methylering wordt toegevoegd aan de lysine of arginine residuen van histonen H3 en H4, met verschillende effecten op transcriptie.et al., 2012) terwijl lysine methylering betrokken is bij zowel transcriptieve activering als repressie, afhankelijk van de methyleringssite.Deze flexibiliteit kan worden verklaard door het feit dat deze methylering de histonenlading niet verandert of rechtstreeks invloed heeft op de histonen-DNA-interacties., in tegenstelling tot acetylering.

Lysines kunnen mono-, di- of tri-gemethyleerd zijn, waardoor elke methylplaats een verdere functionele diversiteit heeft.zowel mono- als tri-methylering op K4 van histone H3 (H3K4me1 en H3K4me3) zijn activeringsmarkers, maar met unieke nuances: H3K4me1 markeert meestal transcriptieversterkers, terwijl H3K4me3 genpromotoren markeert.tri-methylatie van K36 (H3K36me3) is een activeringsmarker die geassocieerd wordt met getranscribeerde gebieden in genen.

Daarentegen zijn tri-methylatie op K9 en K27 van histone H3 (H3K9me3 en H3K27me3) repressieve signalen met unieke functies:H3K27me3 is een tijdelijk signaal in promotorregio's dat ontwikkelingsregulatoren in embryonale stamcellen controleertOndertussen is H3K9me3 een permanent signaal voor het ontstaan van heterochromatine in genarme chromosomale regio's met tandemherhalingsstructuren, zoals satellietherhalingen,telomerenHet markeren ook retrotransposonen en specifieke families van zinkvingergenen (KRAB-ZFPs).met H3K27me3 in intergene en gestilde coderende gebieden en H3K9me3 voornamelijk in coderende gebieden van actieve genen.

Enzymatische regulering

Histon methylering is een stabiel teken dat zich verspreidt via meerdere celverdelingen en werd jarenlang als onomkeerbaar beschouwd.Het is onlangs ontdekt dat het een actief gereguleerd en omkeerbaar proces is..

Methylering: histonenmethyltransferasen (HMT's)

• Lysine

SET-domein bevattende (histone staarten)

niet-SET-domein bevattende (histonkernen)

• Arginine

PRMT (protein arginine methyltransferasen) familie

Demethylatie: histonedemethylazen

• Lysine

KDM1/LSD1 (lysine-specifieke demethylase 1)

JmjC (Jumonji domein bevattende)

• Arginine

PAD4/PADI4

Fosforylering

De histonfosforylering is een cruciale tussenstap in de chromosoomcondensatie tijdens celdeling, transcriptie-regulatie en DNA-schadeherstel (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al.,2015)In tegenstelling tot acetylering en methylering, vestigt histonfosforylering interacties tussen andere histonmodificaties en dient het als een platform voor effectorproteïnen.wat leidt tot een cascade van gebeurtenissen stroomafwaarts.

Fosforylering vindt plaats op alle kernhistonen, met verschillende effecten op elk. Fosforylering van histone H3 op serine 10 en 28, en histone H2A op T120,zijn betrokken bij chromatinecompressie en de regulering van chromatine structuur en functie tijdens mitoseDit zijn belangrijke markers van de celcyclus en celgroei die in eukaryoten worden bewaard.Phosforylering van H2AX bij S139 (met als resultaat γH2AX) dient als een wervingspunt voor DNA-schade reparatie eiwitten (Lowndes et al.., 2005, Pinto et al., 2010) en is een van de vroegste gebeurtenissen die zich voordoen na DNA-dubbelstrengbrekingen.H2B-fosforylering is niet zo goed onderzocht, maar het is gebleken dat het de apoptose-gerelateerde chromatinecondensatie vergemakkelijkt., DNA-fragmentatie en celdood (Füllgrabe et al., 2010).

Ubiquitering

Alle histone kern eiwitten kunnen worden ubiquityled, maar H2A en H2B zijn het meest voorkomend en zijn twee van de meest ubiquityled eiwitten in de kern (Cao et al., 2012).Histone-ubiquitylering speelt een centrale rol in de DNA-schade-reactie.

De meest voorkomende vormen zijn monoubiquitylated H2A op K119 en H2B op K123 (gist) /K120 (werveldieren).Monoubiquityleerde H2A wordt ook geassocieerd met gen-silencering, terwijl H2B ook geassocieerd wordt met transcriptie activering.

Poly-ubiquitylation is minder vaak maar is ook belangrijk bij DNA-reparatie. Poly-ubiquitylation van H2A en H2AX op K63 biedt een herkenningsplaats voor DNA-reparatie eiwitten, zoals RAP80.

Enzymatische regulering

Net als bij andere histonmodificaties is de monobikwitylering van H2A en H2B omkeerbaar en wordt deze strak gereguleerd door histone-ubiquitine-ligasen en deubiquitylerende enzymen.

Monobikytylatie

• H2A: proteïnen van de polykombengroep
• H2B: Bre1 (gist) en zijn homologen RNF20/RNF40 (zoogdieren)

Polyubiquitratie

• H2A/H2AX K63: RNF8/RNF168
   

Snelle gids voor histonmodificaties

Tabel 1. Een cheat sheet voor de meest voorkomende histone modificaties enwaar ze te vinden zijn:

Het bestuderen van histonmodificaties door ChIP

ChIP gebruikt antilichamen om een eiwit of een wijzigingsreeks van belang te isoleren, samen met het DNA waaraan het wordt gebonden (figuur 5).Het DNA wordt vervolgens ge sequenceerd en in het genoom gezet om de locatie en overvloed van het eiwit of de modificatie te identificeren..

Figuur 2: Histone-modificatie CHIP

Immunoprecipitatie en DNA-zuivering maken het mogelijk de genomische gebieden die de modificaties bezetten te isoleren en te identificeren.

Het gebruik van antilichamen tegen specifieke histonen en histonmodificaties in ChIP-experimenten kan de specifieke locaties van

• Chromatine-structuren van hogere orde, bv. H3K9me3 merkt heterochromatine en satellietherhalingen
• Actieve of uitgeschakelde genen en genetische programma's, bv. AH3K9ac markeren genactivatie
• Genetische elementen zoals promotors en enhancers, bijvoorbeeld H3K27me3 markeren promotors in genrijke regio's, H3K4me1 markeren actieve enhancers

Als de functie van een histonwijziging bekend is, kan ChIP specifieke genen en regio's met deze histonwijzigingssignatuur en de bijbehorende functie in het hele genoom identificeren.Deze genen en regio's kunnen vervolgens verder worden onderzocht op hun rol in het biologische proces van belangHet gebruik van ChIP tegen H3K4me1, bijvoorbeeld, zal de locaties en sequenties van actieve versterkers in het hele genoom onthullen, wat wijst op genen en genetische programma's van belang.

Als de functie van de histonmodificatie niet bekend is, kan ChIP sequenties, genen en locaties met deze handtekening identificeren.die vervolgens kan worden gebruikt om de functie van de wijziging af te leidenDeze techniek was van cruciaal belang bij het decoderen van een groot deel van de histoncode en is nog steeds waardevol bij het vaststellen van de functie van nieuw ontdekte modificaties zoals ubiquitylation en andere nieuwe markeringen.

Histon-modificerende enzymen: schrijvers en wegveegmiddelen
- Ik weet het niet.

Histone modificaties worden dynamisch toegevoegd en verwijderd van histone eiwitten door specifieke enzymen (tabel 2).,en op welke niveaus, om uiteindelijk te controleren of specifieke genetische programma's en de cellulaire processen die ze regelen, worden ingeschakeld of uitgeschakeld.

Tabel 2. De belangrijkste categorieën histone-schrijvers en -wissers:

Het identificeren van modificatieroutes en de specifieke schrijvers en uitwissers die in het spel zijn, kan onthullen:

• Relevante cellulaire paden, genetische programma's en fysiologische effecten voor verder onderzoek.Bijvoorbeeld, histone deacetylases (HDAC's) activeren immuunontwikkelingswegen, terwijl histone acetyltransferases (HAT's) een cruciale rol spelen bij differentiatie en proliferatie.
• Onbalans tussen schrijvers en erasers die genetische programmering veranderen en ziekteprocessen veroorzaken.Het karakteriseren van dergelijke onevenwichtigheden, en de specifieke enzymen die erbij betrokken zijn, kan inzicht geven in ziektepatologie, van kanker tot auto-immuunziekten.
• Nieuwe doelwitten en therapeutische strategieën.Zodra een onevenwichtigheid is vastgesteld, kunnen geneesmiddelen worden ontwikkeld om de activiteit van deze enzymen te beïnvloeden en de onevenwichtigheid te corrigeren.nieuwe therapeutische strategieën bieden tegen ziekten die tot nu toe de medische inspanningen hebben ontwekenBijvoorbeeld, veel HDAC-remmers zijn in ontwikkeling als nieuwe geneesmiddelen tegen kanker en ontstekingsziekten zoals artritis en diabetes type I.

Voor de drugontwikkelingsinspanningen kunnen verbindingen gemakkelijk worden gescreend op hun impact op de activiteit van schrijver en uitveegmiddel.

Karakteriserende histon methyleringsroutes

In het algemeen zijn histonmethyltransferase-assays (HMT) moeilijk te ontwikkelen en hebben de meeste verschillende nadelen als gevolg van het ontwerp van de assay.3H-SAM als methyldonor en meet S-adenosylhomocysteïne (SAH) als algemeen bijproduct van de methyleringsreactie.

• Handhaving van radioactief materiaal
• Hoge gevoeligheid voor het overwinnen van lage k_kat(omzet meestal < 1 min-1) en K_Mwaarden voor de methyldonor, SAM
• Voorafgaande zuivering van enzym-/eiwitcomplexen om de activiteit van specifieke HMT's te beoordelen

Abcam HMT-activiteitstests overwinnen deze moeilijkheden door de activiteit van specifieke HMT's te beoordelen met antilichamen die het specifieke gemethyleerde product detecteren, waarbij:

• Eenvoudige colorimetrische of fluorometrische detectie, zonder radioactiviteit
• Compatibiliteit met nucleaire extracten of gezuiverde eiwitten (de test is specifiek voor de relevante wijziging)
• Gegevens over 3 uur

Karakterisering van demethylase-activiteit

Histone demethylase-activiteitstesten meten meestal de vorming van formaldehyde, een bijproduct van demethylatie.Thiolgroepen en een reeks ionenNet als methylatieonderzoeken zijn deze tests niet specifiek voor demethylase en kunnen alleen met gezuiverd eiwit worden uitgevoerd.

De histonedemethylase-assays van Abcam® omzeilen deze problemen door rechtstreeks de vorming van het demethyleerde product te meten, waarbij:

• Verhoogde gevoeligheid (20 ‰ 1000 keer) ten opzichte van formaldehyde-gebaseerde tests
• Meer nauwkeurige gegevens zonder interferentie van thiolen, detergentia of ionen
• Compatibiliteit met nucleaire extracten of gezuiverde eiwitten (vanwege de specificiteit van de test voor de relevante wijziging)
• Metingen van demethylase-activiteit van een breed scala van soorten, waaronder cellen/weefsels van zoogdieren, planten en bacteriën
• Snel microplate-formaat met eenvoudige colorimetrische of fluorometrische metingen
• Gegevens over 3 uur

Karakteriserende histonacetyleringsroutes

Abcam biedt kits om de totale, evenals de H4-specifieke, HAT-activiteit te analyseren.die het geacetyleerde peptide en CoA-SH genereertHet CoA-SH-bijproduct wordt vervolgens gemeten met behulp van colorimetrische of fluorometrische methoden:

• Colorimetrische assays- CoA-SH fungeert als een essentieel co-enzym voor de productie van NADH, dat reageert met oplosbare tetrazolium kleurstof om een product te genereren dat spectrophotometrisch kan worden gedetecteerd.Deze test is ideaal voor kinetische studies, met continue detectie.
• Fluorometrische analyses- CoA-SH reageert met een ontwikkelaar en een sonde om een product te genereren dat fluorometrisch wordt gedetecteerd.

Karakteriserende histone deacetylase activiteit

HDAC-eiwitten vallen in vier grote groepen (klasse I, klasse IIA, klasse IIB, klasse III, klasse IV) op basis van functie en DNA-sequentie-gelijkenis.en IIB worden beschouwd als "klassieke" HDAC' s waarvan de activiteiten worden geremd door trichostatine A (TSA), terwijl klasse III een familie van NAD is+Klasse IV wordt beschouwd als een atypische klasse op zichzelf, gebaseerd uitsluitend op de gelijkenis van de DNA-sequentie met de andere.

Elk van deze klassen wordt geassocieerd met verschillende cellulaire programma's en kan individueel worden getest met verschillende fluorometrische testen.SIRT's worden meestal geassocieerd met kanker en neurologische ziektenHet opsporen van SIRT-activiteit of het identificeren van geneesmiddelen die de SIRT-activiteit beïnvloeden, kan wijzen op nieuwe diagnostische of therapeutische strategieën voor deze ziekten.

Fluorometrische analyses maken gebruik van een geacetyleerd peptide substraat met een fluorophore en een blusmiddel aan de amino- en carboxylterminals.het vrijgeven van de fluorophore uit de blusserDe daaropvolgende toename van de fluorescentieintensiteit van de fluorophore is recht evenredig met de deacetylase-activiteit.

Schrijvers en glijders remmen

Het kan nuttig zijn om deze modificerende enzymen te remmen met behulp van kleine moleculen en vervolgens de gevolgen stroomafwaarts te beoordelen om de betrokkenheid en biologische functies van histonemodificaties te onderzoeken.Inhibitoren van schrijvers en uitwissers zijn essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de rol van epigenetische modificatiepadenDeze zijn ook essentieel voor de validatie van "drugsgebruikbare" doelwitten in de context van preklinische studies, zowel in academische als industriële context.

Histonemodificatielezers/vertalers

Histonmodificaties reguleren de fysische eigenschappen van chromatine en de bijbehorende transcriptietoestand.hetzij rechtstreeks (bijv. acetylgroepen die negatief geladen DNA afstoten om een open chromatineconformatie te creëren) of via eiwitadapters die effectoren worden genoemdEffectorproteïnen herkennen en binden zich aan specifieke epigenetische markeringen en vervolgens rekruten moleculaire machines om de chromatine structuur te veranderen.Deze epigenetische lezers bepalen het functionele resultaat van histonemotificaties door de histoncode in actie te brengen.

Effectordomeinen herkennen specifieke histonmodificaties

Effectorproteïnen herkennen en binden zich aan histonemodificatiemerkers via effectordomeinen, bekend als modules (tabel 3).

Deze modules herkennen specifieke histonmodificaties met aminozuren die de bindingspakket van de module bekleden.residuen buiten deze bindingspakket (met name in de N+2- en N-2-posities) bepalen de specificiteit van het te wijzigen histon- en aminozuurresidu (bijv. H3K4 vs. H4K20).

De kleine verschillen in residuen in of buiten de bindende zak maken het mogelijk om vergelijkbare epigenetische merken te herkennen.of tri-methylatie met lichte variaties in de methylbindingsmodule's structuurBijvoorbeeld, Tudor domeinen kunnen uitsluitend di- of tri-methyleerde lysines binden, terwijl PHD vingermodules kunnen binden aan beide, of alleen aan onveranderde lysines (Ruthenburg et al., 2007).

Multivalency maakt het mogelijk om de complexiteit van de histonencode te verbeteren

In hetzelfde eiwit en/of eiwitcomplex worden vaak meerdere histonbindende modules aangetroffen, waardoor specifieke combinaties van histonmodificaties kunnen worden herkend.Dit maakt een complexere histonencode mogelijk, waarbij histonmodificaties met elkaar samenwerken in plaats van apart te worden geïnterpreteerd.

Multivalente betrokkenheid van histonemodificaties is belangrijk voor het herkennen van discrete markeringspatronen met samengestelde specificiteit en verbeterde affiniteit.De Commissie heeft de Commissie verzocht om een verslag uit te brengen over de resultaten van de evaluatie.Een enkel epigenetisch merk (zoals H3K4me3) kan bijvoorbeeld de gentranscriptie in één context activeren, maar in een andere onderdrukken, afhankelijk van de omringende merken.Tabel 4 toont voorbeelden van enkele van de functionele associaties van verschillende combinaties van histonemodificaties (Ruthenburg et al.., 2007).

Tabel 4. Functionele associaties van co-existerende histon- en DNA-modificaties:

Meerdere effectormodules in een eiwit of complex kunnen interactie hebben met histonmodificaties op dezelfde of over verschillende histonen en/of nucleosomen.

Intranucleosomale:binding aan hetzelfde nucleosoom

• Cis-histone: binding aan dezelfde histone staart
• Transhistone: binding aan verschillende histone staarten

Internucleosomaal:binding aan verschillende nucleosomen

• Naastliggende bruggen: binding aan naastgelegen nucleosomen
• Discontinuous bridging: binding aan niet aangrenzende nucleosomen

Referenties

Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., en Zhao, K. Hoge-resolutie profilering van histon methylaties in het menselijk genoom.823-837 (2007).

Cao, J. & Yan, Q. Histone-ubiquitinatie en deubiquitinatie in transcriptie, DNA-schade-respons en kanker.

Füllgrabe, J., Hajji, N. & Joseph, B. Het kraken van de doodscode: apoptose gerelateerde histonmodificaties.

Greer, E. L. & Shi, Y. Histon methylering: een dynamisch teken in gezondheid, ziekte en erfelijkheid.

Kim, J. & Kim, H. Recruitment en biologische gevolgen van histonmodificatie van H3K27me3 en H3K9me3.

Kschonsak, M. & Haering, C. H. Het vormen van mitotic chromosomen: van klassieke concepten tot moleculaire mechanismen.

Lowndes, N. F. & Toh, G. W.-L. DNA-reparatie: het belang van het fosforyleren van histone H2AX. Curr. Biol. 15, R99?? R102 (2005).

Pinto, D. M. S. & Flaus, A. Structuur en functie van histone H2AX. Subcel. Biochemie. 50, 55?? 78 (2010).

Rossetto, D., Avvakumov, N. & Côté, J. Histonfosforylering: een chromatine-modificatie die betrokken is bij diverse nucleaire gebeurtenissen.

Roth, S. Y., Denu, J. M. & Allis, C. D. Histone-acetyltransferasen.

Ruthenburg, A.J., Li, H., Taverna, S.D., Patel, D.J. & Allis, C.D. Multivalente betrokkenheid van chromatine modificaties door gekoppelde bindende modules.

Voigt, P., Tee, W.W. en Reinberg, D. Een dubbele kijk op bivalente promotors.