Gedetailleerde inleiding

Om het beste effect van de productie van antilichamen te verkrijgen, is het noodzakelijk het antigeen polypeptide zorgvuldig te ontwerpen, en het ontwerp moet voldoen aan een basisvoorwaarde: in het proces van immunisatie,het antigeen zal geen overmatige immuunrespons veroorzaken, en tegelijkertijd kan het produceren genereren antilichamen die zich binden aan het eiwit van belang.

In het algemeen wordt aanbevolen dat de sequentielengte van het antigeen polypeptide tussen 8 en 20 aminozuurresidu's ligt.er is een risico dat de specificiteit van het polypeptide niet sterk is en dat de binding tussen het gegenereerde antilichaam en het native eiwit niet sterk genoeg isAls de sequentie echter langer is dan 20, is het mogelijk een secundaire structuur in te voeren en kan het resulterende antilichaam zijn specificiteit verliezen.Hoe moeilijker het is om te synthetiserenMet jarenlange ervaring in de synthese van moeilijke peptiden, heeft deKS-V peptide kan efficiënt en snel klaar antigeenpeptiden van hoge zuiverheid leveren om uw onderzoek en ontwikkeling te ondersteunen.

Toepassingen

Hoewel de meeste korte, lineaire peptidefragmenten van eiwitten in waterige oplossing ongestructureerd zijn,Er is aangetoond dat een aantal immunogene en antigene peptiden conformatieve voorkeuren hebben voor gestructureerde vormen.Door hoofdzakelijk NMR- en CD-spectroscopie te gebruiken, is het mogelijk geweest om vrij kleine populaties van bèta-turn, helicale en ontluikende helicale conformaties te detecteren en te kwantificeren.Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van gestructureerde vormen gecorreleerd is met de plaats van T-cel- en/of B-cel-epitopen in peptide-sequenties.De röntgenkristallenstructuren van complexen tussen peptiden en antipeptide-antistoffen laten vaak de peptiden zien die in bèta-turnconformaties gebonden zijn.en de aanwezigheid van een helix in een peptide-antilichaamcomplex is aangetoond door NMR-spectroscopie. Studies of peptides free in solution and bound to anti-peptide antibodies in the crystal indicate that the structure of the principal neutralizing determinant of HIV-1 probably includes at least one beta-turn in a highly conserved regionDeze resultaten kunnen potentieel worden gebruikt bij het ontwerpen van peptidevaccinen.

Voordelen van het gebruik van peptideantigenen

In de eerste plaats bieden peptideantigenen een slimme oplossing voor de productie van antilichamen in gevallen waarin de aminozuurvolgorde van het doelproteïne bekend is, maar het eiwit zelf niet beschikbaar is.of structureel te complex om als structureel stabiel en intact eiwit te worden verkregen (e.g. bepaalde transmembrane receptoren, ionkanalen, enz.).de peptide-immuunstofbenadering biedt flexibiliteit bij het selecteren en ontwerpen van antigenen voor domeinen van het doelproteïne als extra voordeelPeptide-antigenen zijn ook zeer nuttig voor het genereren van antilichamen tegen post-translationeel gemodificeerde bindingslocaties op doelproteïnen.

Andere voordelen zijn:

• De epitope is vanaf het begin goed gedefinieerd.
• De proteïne-sequentie is alles wat nodig is.
• een veel lagere kans op kruisreactiviteit
• het antigeen is volledig synthetisch, wat kosteneffectief is met meestal zeer korte levertijden

Ontwerpstrategieën voor peptideantigenen

Hoewel veel peptide sequenties immunogeen kunnen zijn, zijn ze niet allemaal even effectief in het genereren van antilichamen met reactiviteit tegen het doelprotein.De succesvolle productie van antilichamen met peptideantigenen is afhankelijk van verschillende factoren die bij het ontwerp in aanmerking moeten worden genomen., met inbegrip van:

de nauwkeurigheid van de aminozuursequentie van het doelproteïne
de voorspelde 2ary / 3ary structuur van het intacte eiwit
de selectie van de domeinen/regio's van het eiwit die door het peptideantigeen moeten worden nagemaakt
de noodzaak om peptideantigenen te conjugeren naar een groter dragerproteïne
het gemak van de synthese van bepaalde peptide sequenties
Daarom zijn de volgende algemene aanbevelingen van toepassing op het ontwerp van peptideantigenen:

Zorg ervoor dat de juiste soorten en eiwitsequentie zijn geïdentificeerd.
Selecteer het peptide-antigeen uit een oplosmiddel-toegankelijk gebied van het inheemse eiwit.dit zijn gebieden die aan het eiwitoppervlak zijn blootgesteld en die in contact komen met de waterige (hydrofiel) omgeving van het oplosmiddelBepaalde gebieden van het eiwit kunnen ontoegankelijk zijn voor antilichamen, zoals transmembrane gebieden of het centrum van een bolvormig eiwit.

Een belangrijk voordeel is dat peptideantigenen kunnen worden ontworpen om een specifieke epitop van belang te dekken.Sommige domeinen kunnen ook aanwezig zijn in andere eiwitten: deze sequenties moeten worden vermeden om de kans op ongewenste kruisreactiviteit te minimaliseren en zo uw algemene antilichaamspecificiteit te optimaliseren.Sequenties met een minimale sequentiehomologie worden het beste geselecteerd om ongewenste binding aan eiwitten buiten het doel te verminderen..

Afhankelijk van de 3D-structuur van het doeldomein in het intacte eiwit kunnen beperkende technieken nodig zijn om de tertiaire structuur van het antigeen optimaal na te bootsen.Als een van de specialisten in eiwitoppervlakte mimicry, KS-V beschikt over verschillende (gedeeltelijk eigen) technologieën voor het ontwerp en de synthese van conformatieve beperkte peptideantigenen.

De genen zijn vaak te klein om een significante immuunrespons te genereren zonder voorafgaande conjugatie met een drager eiwit zoals KLH, BSA of OVA.Gewoonlijk wordt daarom aanbevolen het gebruik van peptide- ∆ dragerproteineconjugaten..

Synthese van peptideantigenen

Bij het ontwerp van de peptideantigenen moet ook rekening worden gehouden met de gemakkelijkheid van de synthese van specifieke peptide sequenties.en het is gunstig voor het peptide om aminozuren op te nemen die immunogeniteit bevorderen (zoals basis- en aromatische aminozuren)Voor het bereiken van de peptide-oplosbaarheid dient het gehalte aan hydrofobische aminozuren het beste onder de 50% te worden gehouden en moeten bij voorkeur ook lange ketens van hydrofobische residuen worden vermeden.ten minste één geladen residu (arginine), glutamine, asparaginezuur of lysine) moeten worden opgenomen in elke vijf aminozuren.De peptideoplosbaarheid kan ook worden verbeterd door conservatieve vervangingen of toevoeging van polaire residuen aan de N- of C-eindBij het ontwerpen van de antigenen wordt bij voorkeur vermijdt dat er complexe gebieden, zoals bèta-platen of alfa-helices, zijn, maar wordt in plaats daarvan gestreefd naar flexibele gebieden.

KS-V past zijn geavanceerde capaciteiten en expertise toe voor de synthese van peptideantigenen, met inbegrip van (indien vereist) conformatieve beperkingen, PTM's, conjugatie of biotinylering.Voor de meeste antilichaamgeneratieprojecten wordt voor elk peptideantigeen een zuiverheid van ten minste 85% aanbevolen.Als we willen kunnen we echter ook antigenen met een hogere zuiverheid leveren, we synthetiseren meestal ongeveer 10 mg peptide, wat meestal voldoende is voor eiwitconjugatie,ELISA-screening en indien gewenst het opzetten van een affiniteitsmatrixchromatografie.